檢驗介紹
MLPA-基因劑量(gene dosage)診斷技術
何謂"MLPA"？MLPA為”Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification”的簡稱，係由荷蘭商MRC-Holland的Dr. Schouten JP所帶領的研發團隊於2002年開發完成的基因序列拷貝數檢測技術，為目前國際公認DNA拷貝數定量的黃金標準(Gold standard)。
MLPA係透過簡單的雜合(hydriation)、連接(ligation)及PCR增幅(PCR amplication)反應，於單一反應管內可同時偵測最多達60個不同的基因組DNA序列的拷貝數變化。此技術方法操作十分簡單，實驗室只要有PCR及毛細管電泳設備(DNA定序儀)即可進行，結果可在24小時內獲得。MLPA反應MLPA反應可分為五個主要步驟：1）DNA變性和MLPA探針的雜合; 2）連接反應; 3）PCR反應; 4）毛細管電泳分離PCR擴增產物; 5）片段數據分析(如附圖)。
首先讓DNA變性並與MLPA探針混合物混合進行過夜雜合反應。MLPA探針係由兩個單獨的寡核苷酸組成，每個寡核苷酸含有一個PCR引物序列。兩種探針寡核苷酸與緊鄰的目標序列雜合（圖-步驟1）。只有當兩個探針寡核苷酸都與它們的相鄰靶雜合時，它們才能在連接反應期間連接（圖步驟2）。而在隨後的PCR反應中只有連接的探針會以指數方式擴增（圖-步驟3），探針連接產物的數量是樣品中目標序列數量的量度。之後透過毛細管電泳分離PCR擴增產物（圖-步驟4）。而未連接的探針寡核苷酸僅含有一個引物序列，就不會以PCR放大產生訊號。因此，在MLPA中不需要去除未結合的探針，並且使MLPA方法易於執行。最後再透過片段分析軟體將獲得的波峰圖案與參考樣品的波峰圖案進行比較，來確認哪些目標序列顯示異常拷貝數（圖-步驟4）。MLPA的優點◎ 靈敏度高(High sensitivity)：MLPA每次反應只需大約20 ng以上DNA，且毋須準確定量。
◎ 再現性高(High reproducibility)：每次以50-100 ng之DNA量進行MLPA反應，其每一探針之變異係數(Coefficient of variability)約僅3-8%。也就是說，只要檢體DNA量足夠(建議在50-250 ng之間)，所得到的結果再現性非常高。相反的其他相對定量方法，如QPCR或DHPLC等，則容易因DNA定量的不準確，導致結果誤差。
◎ 簡單(Simple)：每一反應只需在同一試管內進行，操作方便簡單。
◎ 高通量處理(High throughput)：MLPA搭配自動化設備，可在三小時內同時處理96個檢體。檢體從DNA萃取、MLPA反應至結果分析，僅需兩個工作天。
◎ 低耗費(Low cost per data point)：反應所須之所有試劑均包含於MLPA試劑組中，所須之儀器設備亦為大部分分子診斷實驗室現有的，無須另行添購。
◎ 反應量及品質的監控(Quantity & quality control)：MLPA檢測包含有監控DNA品質及反應品質的控制組探針，可同時監控DNA反應量是否足夠與反應是否正常。
◎ 探針拷貝數診斷精確：MLPA檢測搭配有十數個控制組探針(位於不同染色體上)，經過標準化(normalization)運算，可避免單一探針反應之誤差而導致定量錯誤，所得到之定量結果準確度也大幅提高。而其他定量檢測方式，由於偵測反應中沒有或只有1-2個控制組探針(internal control)，故準確性不若MLPA。
MLPA的應用至今MRC-Holland原廠已開發出超過400種以上的MLPA試劑組，應用於各種基因拷貝數變化所導致的疾病診斷上，如染色體數目異常(Trisomy13、18、21及XY性染色體數目異常)、遺傳疾病基因缺失重複(如SMA、DMD、F8 & F9基因…等)、基因甲基化偵測(如Prader-Willi syndrome (PWS) and Angelman syndrome (AS))、抑癌基因診斷(如Breast cancer、Lung cancer…等)等。
雖然對於大多數遺傳性疾病來說，基因缺失或重複佔所有致病突變的比率不到10％，但在臨床上，透過MLPA檢測可以顯著提高許多遺傳疾病的檢出率。
由於MLPA操作簡便、成本低廉、應用領域廣，這些年來，已成為各大遺傳疾病基因檢驗中心必備的檢驗技術及平台。
MLPA係透過簡單的雜合(hydriation)、連接(ligation)及PCR增幅(PCR amplication)反應，於單一反應管內可同時偵測最多達60個不同的基因組DNA序列的拷貝數變化。此技術方法操作十分簡單，實驗室只要有PCR及毛細管電泳設備(DNA定序儀)即可進行，結果可在24小時內獲得。MLPA反應MLPA反應可分為五個主要步驟：1）DNA變性和MLPA探針的雜合; 2）連接反應; 3）PCR反應; 4）毛細管電泳分離PCR擴增產物; 5）片段數據分析(如附圖)。
首先讓DNA變性並與MLPA探針混合物混合進行過夜雜合反應。MLPA探針係由兩個單獨的寡核苷酸組成，每個寡核苷酸含有一個PCR引物序列。兩種探針寡核苷酸與緊鄰的目標序列雜合（圖-步驟1）。只有當兩個探針寡核苷酸都與它們的相鄰靶雜合時，它們才能在連接反應期間連接（圖步驟2）。而在隨後的PCR反應中只有連接的探針會以指數方式擴增（圖-步驟3），探針連接產物的數量是樣品中目標序列數量的量度。之後透過毛細管電泳分離PCR擴增產物（圖-步驟4）。而未連接的探針寡核苷酸僅含有一個引物序列，就不會以PCR放大產生訊號。因此，在MLPA中不需要去除未結合的探針，並且使MLPA方法易於執行。最後再透過片段分析軟體將獲得的波峰圖案與參考樣品的波峰圖案進行比較，來確認哪些目標序列顯示異常拷貝數（圖-步驟4）。MLPA的優點◎ 靈敏度高(High sensitivity)：MLPA每次反應只需大約20 ng以上DNA，且毋須準確定量。
◎ 再現性高(High reproducibility)：每次以50-100 ng之DNA量進行MLPA反應，其每一探針之變異係數(Coefficient of variability)約僅3-8%。也就是說，只要檢體DNA量足夠(建議在50-250 ng之間)，所得到的結果再現性非常高。相反的其他相對定量方法，如QPCR或DHPLC等，則容易因DNA定量的不準確，導致結果誤差。
◎ 簡單(Simple)：每一反應只需在同一試管內進行，操作方便簡單。
◎ 高通量處理(High throughput)：MLPA搭配自動化設備，可在三小時內同時處理96個檢體。檢體從DNA萃取、MLPA反應至結果分析，僅需兩個工作天。
◎ 低耗費(Low cost per data point)：反應所須之所有試劑均包含於MLPA試劑組中，所須之儀器設備亦為大部分分子診斷實驗室現有的，無須另行添購。
◎ 反應量及品質的監控(Quantity & quality control)：MLPA檢測包含有監控DNA品質及反應品質的控制組探針，可同時監控DNA反應量是否足夠與反應是否正常。
◎ 探針拷貝數診斷精確：MLPA檢測搭配有十數個控制組探針(位於不同染色體上)，經過標準化(normalization)運算，可避免單一探針反應之誤差而導致定量錯誤，所得到之定量結果準確度也大幅提高。而其他定量檢測方式，由於偵測反應中沒有或只有1-2個控制組探針(internal control)，故準確性不若MLPA。
MLPA的應用至今MRC-Holland原廠已開發出超過400種以上的MLPA試劑組，應用於各種基因拷貝數變化所導致的疾病診斷上，如染色體數目異常(Trisomy13、18、21及XY性染色體數目異常)、遺傳疾病基因缺失重複(如SMA、DMD、F8 & F9基因…等)、基因甲基化偵測(如Prader-Willi syndrome (PWS) and Angelman syndrome (AS))、抑癌基因診斷(如Breast cancer、Lung cancer…等)等。
雖然對於大多數遺傳性疾病來說，基因缺失或重複佔所有致病突變的比率不到10％，但在臨床上，透過MLPA檢測可以顯著提高許多遺傳疾病的檢出率。
由於MLPA操作簡便、成本低廉、應用領域廣，這些年來，已成為各大遺傳疾病基因檢驗中心必備的檢驗技術及平台。